본 연구팀은 염증 부위로 움직이는 T 세포를 운동성이 높은 T 세포와 운동성이 낮은 T 세포로 분리하여 전사체 분석 (Microarray)을 실행했고, 운동성이 높은 T 세포에서 특이적으로 많이 발현하는 유전자들을 선별했다. 이 유전자들 중 하나가 CCDC55 였으며, 본 연구팀은 연구를 통해 유전자의 이름을 핵 내 작은 반점이란 뜻으로 Nuclear Speckle-related protein 70 (NSrp70)라고 명명했다. 70의 뜻은 이 단백질의 무게가 70 kDa이란 뜻이다.
본 연구팀은 NSrp70 단백질을 세포에 과발현 시켰을 때 핵 내 작은 반점(speckle) 모양으로 위치하는 것을 확인했고 (아래 그림 A), nuclear speckle (NS)에 위치하며 RNA의 alternative splicing (AS)에서 중요한 역할을 한다고 잘 알려진 SR 단백질 ASF/SF2 (SRSF1) & SC35 (SRSF2) 들과 NSrp70가 NS에 동일하게 위치하고 있음을 발견했다 (아래 그림 B). 또한 NSrp70가 SR 단백질들과 마찬가지로 RNA의 AS을 조절할 수 있다는 것을 처음으로 확인했다 (아래 그림 C). 이후 NSrp70의 생리학적 기능 연구를 위해 유전자 삭제 쥐 모델 (whole body knock-out mouse)을 만들었으나, 쥐 태아들이 태어나기도 전에 배아 단계에서 죽는 것을 발견했다 (아래 그림 D). 이 결과를 통해 이 유전자는 AS 조절 뿐 아니라 전반적인 생명체의 발달 과정에서 중요한 생리학적 역할을 수행하고 있다는 것을 밝혔다. 본 연구 결과는 Nucleic Acids Research (2011)에 게재되었다.
NSrp70는 본래 CCDC55라는 유전자 이름으로 NSBI에 등록되어 있었으나, 본연구팀은 위 2011년 연구결과를 근거로 유전자 이름을 NSRP1 (Nuclear speckle Splicing Regulatory Protein 1)로 새로이 명명하였고, HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC; http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=25305)로부터 정식 승인을 획득하였다.
후속 연구로서 본 연구팀은 NSrp70가 AS에 주도적인 역할을 감당하는 SR 단백질들인 SRSF1 & SRSF2와 물리적인 결합을 하는 동시에 NSrp70가 SR 단백질들의 AS 기능에 반대 작용 한다는 것을 밝혔다 (아래 그림 A). 또한 NSrp70 단백질 내 C-말단 서열 (C-terminal sequence)에 위치한 RS-like region의 deletion mutants를 제작하여 (아래 그림 B), SR 단백질들과의 상호작용을 확인해보고자 했다. 본 연구팀은 NSrp70의 첫 번째 RS-like region이 삭제된 RS1M 결과를 통해 RS1 부분이 SRSF1과의 물리적 결합과 핵 내 NS에 동일하게 위치하는데 중요한 역할을 하고 있음을 확인했고 (아래 그림 C), RS1의 부재는 SRSF1의 AS 기능에 대한 NSrp70 반대 작용도 무력화 시키는 것 또한 밝혔다 (아래 그림 D). 본 연구 결과는 The Journal of Biological Chemistry (2016)에 게재되었다.
현재 본 연구팀은 NSrp70 단백질의 발현이 쥐 초기 배아 상태에서 특히 높은 것 (아래 그림 A)과 쥐의 면역 관련 조직 (흉선, 지라, 림프절) 및 CD4+와 CD8+ T 세포에서 특이적으로 NSrp70의 발현이 높은 것을 확인했다 (아래 그림 B). 이를 바탕으로 NSrp70가 T 세포의 발달 과정에서 중요한 생리학적 기능을 하고 있다고 판단한 연구팀은 T 세포의 주요 발달 조직인 흉선 내 흉선 세포 (thymocyte)에 대한 연구를 진행하게 됐다.
앞선 Whole body knock-out 쥐 모델은 배아 과정에서의 사망으로 NSrp70 생리학적 기능 연구의 한계가 있었기에 이번에는 새로이 cre-loxp 시스템을 이용해 흉선 세포에만 조건적으로 NSrp70 유전자를 삭제할 수 있는 conditional Knock-out (KO) 쥐를 이용했다. Wild-type (WT) 쥐와 비교 시 KO 쥐의 흉선 내 성숙 T 세포가 모이는 morula (M) 부분이 크게 줄어 있고, 성숙한 CD4, CD8 single positive (SP) 흉선 세포 발달이 크게 감소한 것을 발견했다 (아래 그림 C). 이후 NSrp70의 AS 기능이 실제 흉선 세포 발달 중 어떤 유전자 타겟을 조절하는지 분석 결과 SRSF1과 SON 등 NS에 위치하면서 주로 mRNA processing에 관여하는 splicing factor들이 다수 발견됐으며, 특히 KO 흉선 세포의 경우 SRSF1의 intron 삽입 전사체가 감소하여 결과적으로 흉선 세포에서 SRSF1의 단백질 발현이 높아진 것을 확인했다 (아래 그림 D). 이를 통해 NSrp70가 SR 단백질과 같은 splicing factor들과 물리적 결합을 통해 AS를 조절 할 뿐 아니라, 직접적으로 SR 단백질과 같은 splicing factor들의 전사체에 직접적으로 AS 조절을 하는 것을 밝혔다. 이런 NSrp70의 작용은 발달 단계에 있는 세포의 전체적인 유전자 전사 (transcription) 및 전사 후 변형 (Post-transcriptional modification)에 영향을 미쳐 세포 주기 및 세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인했다 (아래 그림 F).
이후 본 연구팀은 전사체 분석 (RNA-seq)을 통해 WT 흉선 세포와 비교 시 KO 흉선 세포 내 단백질 번역 (translation) 및 세포 주기와 관련된 유전자들은 발현이 증가하고, TCR 신호 전달 관련 유전자들은 발현이 감소한 것을 발견했다 (아래 그림 A). 또한 실제 KO 흉선 세포의 경우 비정상적인 세포 증식 증가와 그로 인한 세포 사멸이 증가한 것을 확인했고 (아래 그림 B), TCR complex의 발현 감소와 그로 인한 실제 흉선 세포 신호 전달 강도가 약해져 있는 것을 검증했다 (아래 그림 C). 이후 이차면역기관인 림프절과 지라에서의 성체 T 세포 (naïve T cell)를 정량 한 결과 WT에 비해 KO에서 T 세포 수가 크게 감소 했고 (아래 그림 D), 피부암세포를 주입해 고형암 유도 실험을 했을 경우 WT에 비해 KO 쥐의 항암 능력이 크게 감소한 것을 확인하여 NSrp70 KO 모델이 림프구감소증 모델과 유사한 증상을 보임을 검증했다 (아래 그림 E).
본 연구팀은 NSrp70가 T 세포 발달 과정 중 SRSF1과 같은 세포 주기와 증식에 관련된 splicing factor들을 NS에 정상적으로 위치시켜 재 기능을 할 수 있게 유도할 뿐 아니라 이런 splicing factor들의 전사체에 일어나는 AS을 NSrp70가 직접적으로 조절 함으로써 NSrp70가 발달 과정에 있는 세포 내 전체적인 RNA-splicing에 영향을 미치고 있음을 확인했다. (아래 그림 A). 본 연구팀은 최종적으로 NSrp70의 부재로 비정상적인 RNA-splicing 조절이 일어남으로써 세포 주기와 세포 사멸 증가가 유도되고, TCR complex 발현 감소와 TCR 신호 전달의 약화로 인해 KO 흉선 세포가 성숙한 T 세포로 발달하지 못하고 죽게 된다는 것을 밝혔다 (아래 그림 A). 이후 single cell 분석 기법을 통해 실제로 KO 흉선 세포 발달에 이상이 생겨 SP 흉선 세포가 감소함을 확인 했다 (아래 그림 B). 본 연구결과는 Nucleic Acids Research에 투고 후 리비전 중에 있다.
후속 연구로서 본 연구팀은 이전 AS 분석과 single cell 분석 데이터를 토대로 NSrp70가 어떤 타겟을 통해 이후 성숙한 T 세포의 발달과 분화 과정에 영향을 미치는 지속적으로 연구 중에 있다.
